生科高宁研究组与合作者发表DNA复制起点识别复合物3-Å分辨率的冷冻电镜结构

2018年7月4日，北京大门生命科学学院、北京大学-清华大门生命科学联合中间高宁教授课题组与香港科技大学戴碧瓘教授课题组合作，在《天然》（Nature）杂志以长文情势发表题为“Structure of the origin recognition complex bound to DNA replication origin”的研究论文，报道了结合有复制起点DNA（ARS305）的酿酒酵母起点识别复合物（ORC）3-Å分辨率的冷冻电镜结构。此高分辨率结构不仅为理解酵母ORC如何识别和结合序列特异性的DNA复制起点提供了分子基础，同时也阐明了ORC如何通过弯曲DNA来进一步加载DNA复制解旋酶MCM2-7的分子过程。

DNA复制肇端在真核生物细胞体中受到严酷细密调控。DNA复制启动因子首先结合到DNA复制起点，以加载DNA复制解旋酶MCM2-7复合物到DNA上，随后MCM2-7被激活，DNA双链被解螺旋，从而启动DNA复制。真核生物的复制启动因子ORC由六个亚基组成。所有真核生物都是行使ORC来标记DNA复制肇端的位点。除了在基因组稳固性以及肿瘤的发生发展中显而易见的紧张作用，人源 ORC复合物的多个亚基（包括ORC1，ORC4，ORC6，Cdc6）的功能缺失突变都和一类罕见遗传发育疾病直接相干（Meier-Gorlin syndrome，MGS）。MGS患者在胚胎期生长迟缓并伴随多种发育畸形，出生后发育也紧张受阻并导致身材矮小、小耳症、膝盖骨缺失等。

虽然在不同的真核生物中，ORC的蛋白质序列高度保守，但是ORC对DNA复制起点序列的选择性在不同物种间差别很大。酿酒酵母的ORC可以识别特异的DNA复制起点，而人源细胞的ORC结合的DNA序列却没有序列特异性，重要依靠染色体结构识别复制起点。ORC序列识别差异背后的分子机制，也一向是个未解之谜。造成这种局面的一个很大的缘故原由，就是多年来一向缺少ORC结合DNA的高分辨结构。已经发表的关于ORC结构中，要么复合物中没有DNA，要么分辨率较低，不足以提供充足的细节信息，我们仍然无法推断ORC与DNA是如何相互作用从而实现其功能的。为了解开这个谜团，高宁课题组和戴碧瓘课题组战胜一些技术难题，合作解析了酿酒酵母ORC结合DNA复制肇端位点3-Å分辨率的冷冻电镜结构。

（a）ORC-起点DNA复合物冷冻电镜结构；（b）复合物结构中DNA在ACS以B1区域的两次弯曲

本文解析的ORC-ARS305 DNA复合物结构中，ARS305包含一段ARS高度保守序列（ARS consensus sequence, ACS）和一段B1元件序列，长度为72 bp。在这个结构中，ORC的六个亚基通过与磷酸骨架的非特异性以及与碱基的特异性相互作用环绕DNA，并在ACS和B1位点使DNA发生弯曲。该结构的一个关键特性是Orc1的保守碱性氨基酸区域（Orc1-BP，basic patch）深深地插入ACS的小沟中进行序列特异的碱基识别。另外，酵母特有的具有物种特异性的位于Orc4 Wing Helix结构域（WHD）中的Helix Insertion（Orc4-IH）嵌入ACS的大沟中，与响应的碱基形成疏水相互作用。紧张的是，在ACS区域形成的这些碱基特异的相互作用的碱基都特别很是保守。此外，在B1区域中，也有类似的来自Orc2和Orc5的碱性氨基酸区域插入到大沟和小沟中，与碱基相互作用，并使DNA弯曲。因此，酿酒酵母ORC高度序列特异性重要是通过ORC亚基的大沟、小沟插入基序与ACS保守碱基之间的特异性相互作用实现的。序列比对分析表现，所有真核生物Orc1的N端都具有类似酿酒酵母的Orc1-BP；然而Orc4-IH却只在酿酒酵母中存在。这些发现，很大程度上诠释了不同物种ORC识别肇端DNA特异性差异背后的缘故原由。

高宁以及戴碧瓘、香港科技大学翟元樑博士（现为香港大学助理教授）为本文的共同通信作者。高宁组的博士后李宁宁、博士生程稼萱以及戴碧瓘组的博士后林伟熙、翟元樑为本文的共同第一作者。高宁组的成二超（2017年已博士卒业）和戴碧瓘组的博士赵永倩参与了研究工作。冷冻电镜数据收集工作重要在北京大学电子显微镜实验室（冷冻电镜平台）完成，平台的李雪梅先生和物理学院的余大启博士在数据收集过程中提供帮助；国家蛋白质科学（北京）设施清华大学冷冻电镜平台为本课题的早期研究提供支撑。冷冻电镜数据处理重要在北京大学高性能计算中间完成，平台主管樊春先生亦提供帮助。本论文得到科技部、国家天然科学基金委、香港研究资助局、中国博士后基金的经费支撑。李宁宁获得北京大学-清华大门生命科学联合中间良好博士后基金的资助。

高宁课题组和戴碧瓘课题组从2013年开始合作，在真核生物DNA复制肇端调控机制的研究方面取得了很好的成果。他们先后解析了酵母DNA复制解旋酶双六聚体复合物Mcm2-7的3.8-Å的冷冻电镜结构（Nature, 2015）以及解旋酶加载到DNA前游离的Mcm2-7六聚体和Cdt1-Mcm2-7七聚体复合物的结构（Nat Struct&Mol Biol, 2017）。

值得一提的是，这是北京大学冷冻电镜平台自2017年秋季正式运行以来，其产出的研究成果首次在国际顶级期刊上发表。ORC-DNA复合物的分子量为400kD左右，颗粒较小，分辨率可以达到3Å，这注解北京大学冷冻电镜平台的硬件建设的初步目标已经圆满达成。

编辑：麦洛