生科汤富酬课题组与合作者建立小鼠精子发生过程高精度转录组图谱

哺乳动物精子发生是一个高度复杂且受到精密调控的细胞发育过程。该过程包含三个最基本的生物学事件：有丝分裂、减数分裂和精子形成。在有丝分裂过程中，精原细胞经历自我更新、增殖和分化，保证了精子发生的持续性和稳固性；在减数分裂过程中，发生同源染色体的精准配对、重组交换与正确星散，在保证遗传稳固性的基础上产生了配子遗传物质的高度多样性；在精子形成过程中，则发生了顶体形成、组蛋白-鱼精蛋白转换、核浓缩和包装重修等一系列复杂的细胞生物学和形态学转变，使精子细胞具备了活动和受精潜能。上述过程中生邃密胞类型的多样性和生物学事件的高度复杂性决定了精子发生是研究基因表达调控的绝佳模型。

经过数十年的深入研究，目前对哺乳动物精子发生的研究仍然存在着很多制约因素。例如，目前尚未有高效和便捷的生邃密胞体外培养系统，而且因为数十类生邃密胞和多种体细胞同时存在于睾丸组织当中，要获取高纯度且处于特定发育阶段的各级生邃密胞是极其困难的。因此，当前对精子发生机制的研究多采用的是对类型混杂的群体细胞的系综平均研究，而非对单个性细胞直接进行体系研究。这就导致长久以来我们对哺乳动物精子发生的调控机制缺乏一个体系周全的理解。

2018年7月30日，国际着名学术期刊Cell Research在线发表北京大门生命科学学院汤富酬教授课题组与中国科学院生归天学与细胞生物学研究所童明汉研究员课题组、李劲松研究员课题组合作的题为“Single-cell RNA-seq Uncovers Dynamic Processes and Critical Regulators in Mouse Spermatogenesis”的最新研究成果。这项工作开创性地将精子发生同步化方法与生殖细胞特异性荧光标记相结合，星散获取了高纯度的处于不同发育阶段的小鼠生邃密胞，并应用高精度单细胞转录组测序的方法，建立了小鼠精子发生过程的转录组邃密图谱。该工作体系揭示了精子发生过程中基因表达调控的动态转变，筛选、验证了不同发育阶段的关键调控因子，证明了不同发育阶段精子细胞与卵细胞结合后产生的胚胎具有不同的发育潜能，并体系总结了精子发生过程中RNA可变剪接的动态转变、减数分裂性染色体失活（MSCI）等多种关键生物学事件的核心规律。

一、精子发生同步化方法获得高纯度各级生邃密胞的策略

精子发生是一个延续且非同步化的过程，体现为生精上皮的细胞组合存在周期性转变，沿生精小管纵轴方向的不同位置处于不同的生精上皮周期。睾丸内生邃密胞类型的复杂性则源于生精上皮周期性释放的维甲酸旌旗灯号——维甲酸为精原细胞分化的必需因子，精原细胞分化的不同步造成了不同生精上皮内生殖细胞组合的多样性。

基于精原细胞分化的机理，该研究通过对复活小鼠延续七天饲喂维甲酸合成通路的克制剂WIN 18,446，使精子发生阻滞于未分化型精原细胞阶段，在第八天通过腹腔注射维甲酸，使精原细胞同步分化。因为分化后的细胞周期相对固定且同步，通过对维甲酸处理不同时间点的小鼠系列取材，可获得不同发育阶段的生邃密胞。而未分化型精原细胞不受同步化的影响，为了避免其污染，该研究构建了生邃密胞特异性携带红色荧光蛋白（Vasa-dTomato）的基因敲入小鼠模型和未分化型精原细胞特异性携带黄色荧光蛋白（Lin28-YFP）的基因敲入小鼠模型。红色单阳性的细胞即为同步化的目的细胞，可以通过单细胞采集体系Unipick获得单个细胞或FACS分选收集目的细胞群体。基于上述方法，该研究星散并鉴定了20类处于精子发生不同时期的细胞类型（图1），并行使高精度单细胞转录组测序的方法建立了上述不同发育阶段的转录组细致图谱。

图1 研究流程示意图及该研究中20种生邃密胞类型

二、生邃密胞转录组的动态转变

通过对20个阶段的1,204个生邃密胞进行高精度单细胞转录组测序，经过严酷的质量控制，剩余1,136个细胞用于后续分析。基因表达数目效果表现，在整个精子发生过程中，生邃密胞必要调动基因组近90%（20,088个基因中的18,037个）的蛋白质编码基因的表达（图2a）；与此同时，各阶段生邃密胞转录水平存在显明的动态转变。其中晚粗线期与双线期精母细胞达到整个精子发生过程的转录峰值，而在晚细线前期与细线期阶段则为转录低谷期（图2a）。聚类效果表现，20类生邃密胞可以划分为七大类。风趣的是，同处于DNA复制的早细线前期与中晚期细线前期，精母细胞被聚类到不同类群之中（C1与C2）（图2b），提醒早细线前期（ePL）向中晚期细线前期（mPL）的变化可能是减数分裂过程潜在的紧张迁移转变点；同为圆形精子细胞的RS2（C5）、RS4与RS6（C6）和RS8（C7）则被分为三群，提醒其功能可能存在明显差异。

图2 （a）箱式图展示了20个阶段的生邃密胞中已知蛋白质编码基因的基因数量；（b）t-SNE分析将生邃密胞划分为C1至C7共七个新类群

三、精子发生过程中关键调控因子的筛选与验证

参与减数分裂过程的新基因

减数分裂是生殖细胞所特有的生物学事件，是生物有性生殖的基础。在此过程中，同源染色体的非姐妹染色单体间发生配对、联会和重组交换，从而使配子呈现遗传多样化，增长了子女的适应性。如此复杂的生物学过程必要浩繁因子的共同和谐，而在此之前已知的调控因子并不周全，有待进一步发掘和阐明。

该研究通过体系的生物信息学分析发现与减数分裂重组过程相干的紧张基因，包括Prdm9、Gm960、Meiob等，它们均特异表达于细线期或偶线期精母细胞内。与此同时，还发现了一些未知基因，包括Fbxo47、Pparg、Ccnb3等也体现出同样的表达模式，提醒这些未知基因可能在减数分裂重组过程中发挥关键调控作用。

该研究选择Fbxo47基因开展进一步的功能验证，此前的报道认为Fbxo47基因和人类癌症相干，但是其详细功能仍是未知。该研究构建了Fbxo47的条件性基因敲除小鼠，功能研究发现生邃密胞内特异性失活Fbxo47基因的小鼠体现为雄性不育。睾丸切片H&E染色效果表现，Fbxo47基因敲除的成年小鼠的精子发生阻滞于生精上皮的第Ⅳ期，同时发生大量精母细胞凋亡的征象（图3a）。免疫荧光染色效果进一步表现，Fbxo47基因敲除的成年小鼠生精上皮内没有粗线期精母细胞及后续细胞类型，体现为减数分裂前期I障碍（图3b）。上述效果进一步证明该研究建立的精子发生过程转录组邃密图谱在筛选参与特定生物学事件的潜在调控因子的可靠性。

图3 （a）8周龄野生型小鼠睾丸和Fbxo47基因敲除小鼠睾丸切片的H&E染色效果；（b）8周龄野生型小鼠和Fbxo47基因敲除小鼠睾丸切片的免疫荧光染色效果。标尺：50 μm

精子发生过程中紧张的转录因子

精子发生过程具有很强的阶段特异性，在不同阶段有着不同的转录特性，而转录因子被认为在精子发生过程中调节了基因表达的时空特异性。

为了探求调控精子发生关键变化节点的转录因子，该研究分别分析了有丝分裂向减数分裂变化过程和减数分裂向精子形成变化过程中的转录因子共表达调控网络。共表达网络效果表现，c-fos/c-jun和Zfp316在有丝分裂向减数分裂变化过程中具有潜在的调控作用（图4a）。而在减数分裂向精子形成变化过程中，除已报道的在生邃密胞发育过程中发挥偏重要功能的Crem和Rfx2外，该研究还筛选出像Sox30和Zfp541如许未知的潜在转录因子（图4b）。

图4 有丝分裂向减数分裂变化（a）及减数分裂向精子形成变化（b）过程中的转录因子共表达调控网络。其中，黄色圆点透露表现各个转录因子，连线透露表现转录因子之间的关联

为了验证这些未知转录因子的作用，该研究对小鼠进行了Sox30基因的全局性敲除或生殖细胞特异性敲除。功能研究发现不论是全局性敲除的小鼠照旧条件性敲除的小鼠，都体现为雄性不育。组织学H&E染色发现，Sox30基因敲除小鼠的精子发生体现为精子形成停滞，生精上皮内没有长形精子，少量的圆形精子细胞聚集形成多核巨型细胞。通过对顶体的染色，发现Sox30基因敲除小鼠的精子发生阻滞于圆形精子形成的第3~4步，提醒Sox30基因在调控精子形成中的关键作用（图5a）。

为了探讨Sox30调控精子的形成机制，研究人员从Sox30条件性基因敲除小鼠中获取了49个第三步圆形精子细胞用于单细胞转录组分析。Sox30基因敲除组和野生型对照组细胞内基因表达差异显明，存在2000多个差异表达基因（1,153个突变组下调基因和895个突变组上调基因）。通过对差异表达基因的GO分析发现，Sox30基因敲除组下调的基因与精子形成密切相干。为了进一步探求受Sox30直接调控的下流靶基因，该研究开展了SOX30的ChIP-seq实验。通过与RNA-Seq的效果共同分析，在基因敲除组下调的基因中找到233个受Sox30直接调控的关键靶基因。通过GO分析发现，这些靶基因与精子形成密切相干，例如Chd5、Hils1和Sun5等（图5b）。

图5 Sox30基因敲除阻碍了小鼠精子细胞的发育：（a）8周龄条件性敲除小鼠（Sox30-cKO）和对照组小鼠（control）的睾丸组织切片H&E染色与荧光染色效果，其中PNA标志精子细胞的顶体；（b）野生型、条件性敲除、全局性敲除小鼠在三个代表性基因上ChIP-seq的效果。比例：50 μm

四、第1_~2步圆形精子相较于第7_~8步圆形精子受精产生的胚胎具有较低的发育潜能

基于该研究建立的各级生邃密胞的高精度转录组数据，研究人员筛选获取了特异性表达于不同发育阶段圆形精子的外观标志物，包括Cd37、Cd63、Cd96和Cd177等（图6a）。流式细胞分选实验证明了CD63阴性能够成功地富集第7~8步的晚期圆形精子细胞；而CD63强阳性则能富集第1~2步的早期圆形精子细胞。这一实验效果提供了一种行使外观标志物星散获取不同发育阶段圆形精子细胞的策略。

为了观察不同发育阶段的圆形精子细胞是否与其授精后胚胎发育潜能相干，该研究进一步通过同步化方法及外观标志物分选的方法分别获取了早期圆形精子细胞和晚期圆形精子细胞，应用胞质圆形精子注射（Intracytoplasmic Round Spermatid Injection，ROSI）实验证明了晚期圆形精子细胞注射所得胚胎发育至囊胚的比率明显高于早期圆形精子细胞注射所得胚胎（图6b）。因此，第1~2步圆形精子相较于第7~8步圆形精子与卵细胞结合后产生的胚胎具有较低的发育潜能；提醒了人类临床上和动物实验中ROSI成功率较低很可能是因为使用的圆形精子细胞中很大一部分是早期圆形精子而导致的。假如能够使用上述新发现的外观标志物将晚期圆形精子特异性富集出来用于ROSI，有可能大幅度进步其成功率。

图6 第1_~2步圆形精子相较于第7_~8步圆形精子具有较低的胚胎发育潜能

五、 精子发生过程中可变剪接的动态转变

在精子发生过程中存在着大量的可变剪接事件。该研究通过对来自精子发生13个关键阶段的66个单细胞进行全长RNA-seq测序，效果发现可变事件在各阶段生邃密胞内的分布情况与基因表达数目的动态转变极为相似，提醒了可变剪接伴随着转录过程，是精子发生过程中转录后调控的紧张体现情势（图7a）。同时，该研究还发如今各个阶段的生邃密胞中，内含子滞留（intron retention）和外显子跳跃（exon-exon junction）类型的可变剪接事件始终是占比最高的可变剪接类型。

图7 （a）柱状图展示了不同精子发生阶段中，每个细胞中至少含有两种可变事件的基因平均数量；（b）堆积柱状图展示了相邻阶段差异基因和可变转变之间的关系

为了研究在相邻阶段之间发生转变的可变剪接事件，该研究将每个阶段的单细胞合并在一路，重新计算每个阶段的可变剪接情况。效果发现，假如仅考虑两个阶段中至少有一个阶段存在可变剪接的情况，可以显明看到内含子保留是占比最高的可变剪接转变，这也就提醒内含子保留可能是参与生邃密胞转录后调控的紧张手段之一。

为了观察可变剪接和基因表达之间的详细关系，该研究分析了相邻阶段之间差异基因的可变剪接转变。效果发现，当生邃密胞夙昔一个阶段过渡到下一个阶段时，上调的差异基因更倾向于保留内含子而克制表达，此时对应的RNA就会先储存起来而不进行蛋白质翻译。然而，下调的差异基因则更多的变化为剪接成熟的转录本，如许的举动有利于正常翻译使用（图7b）。

六、性染色体基因表达的动态转变

在精子发生过程中，性染色体上的基因有其独特的表达体例，即发生减数分裂性染色体沉默（Meiotic Sex Chromosome Inactivation，MSCI）征象。因为受细胞纯度题目困扰，对该征象的理解及其发生机制的研究一向不够深入。

该研究通过细致比较不同发育阶段生邃密胞内性染色体基因表达的水平，细致归纳了不同基因的表达情况，并将这些基因划分成MSCI PMSC、MSCI escape PMSC、escape MSCI等（图8a）。其中PMSC（Post Meiotic Sex Chromosome Inactivation）指的是减数分裂后性染色体相干基因不激活状况，已有的观念认为，性染色体上的基因在完成减数分裂后，依旧处于转录克制状况，此种征象称之为PMSC。同时，该研究发现不同性染色体基因的不同表达模式与其功能密切相干，例如escape MSCI的基因功能与染色质的重塑密切相干，提醒这些基因可能参与了精子形成过程（图8b）。

图8 （a）热图展示了MSCI-PMSC、MSCI-逃逸PMSC、逃逸MSCI、RS特异性等五种类型性染色体上的基因在精子发生过程中的表达转变；（b）逃逸MSCI基因的GO富集分析效果

综上，该工作通过将精子发生同步化技术与单细胞转录组测序技术巧妙地结合起来，绘制了一幅高精度的小鼠精子发生转录组图谱，周全揭示了小鼠精子发生过程中基因表达的高度动态性与时空特异性，并在此基础上对发现的关键候选基因通过基因敲除和直接下流靶基因检测（ChIP-seq）等策略进行深入的功能和机理研究，为后续周全研究精子发生调控机制提供了理论基础和珍贵资源，并对临床男性生殖停滞的诊疗提供了理论引导，为最终阐明哺乳动物精子发生的分子调控机制提供了可能途径。

北京大学北京将来基因诊断高精尖创新中间博士生郑宇轩和高云、中国科学院生归天学与细胞生物学研究所博士后陈瑶、博士生林震和杨苏明为该文章的并列第一作者，汤富酬、童明汉和李劲松为该文章的共同通信作者。此项工作得到中国科学院战略性先导科技专项、科技部（973计划）、国家重点研发计划、上海生科院基金、国家天然科学基金、上海市科委、北京将来基因诊断高精尖创新中间的支撑。

编辑：麦洛